茯磚茶中活性成分的高通量篩選及功能研究
發布時間：2024-09-30 點擊：61
茯磚茶中活性成分的高通量篩選及功能研究
傅冬和
【摘要】： 隨著全球經濟的快速發展，人們生活水平的日益提高，高脂血癥及肥胖癥的患病率不斷上升，且已成為擺在人們面前的首要健康問題。肥胖癥及高脂血癥的預防和治療是當今全球健康產業關注的熱點，尋找天然、高效、安全的降脂減肥藥物或保健食品是全球科技領域和產業領域十分關注的課題。 茶為藥用歷史悠久，隨著現代科學技術的進步和對茶葉藥理功能研究的深入，業已證明茶葉具有降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理功能。湖南是我國茯磚茶的主產區，茯磚茶是邊疆少數民族同胞經歷多年選擇的、日不可缺的必備飲品。本研究采用現代分離純化技術逐級深入分離茯磚茶的有效成分，同步采用高通量篩選、代謝酶活性測試及動物試驗，系統地研究茯磚茶的降脂減肥功效，獲得了如下研究成果： 1．茯磚茶功能成分分離及結構鑒定 將現代分離技術與高通量藥物篩選技術相結合，分離和確定茯磚茶的主要活性成分，首次從茯磚茶中分離得到8個單體化合物。通過綜合運用紅外、紫外、質譜、核磁共振、高效薄層及高效液相色譜等分析技術，確定此8個化合物分別為：沒食子酸、沒食子兒茶素(gc)、3-甲氧基-4，5-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、表沒食子酸兒茶素(egc)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)、表兒茶素沒食子酸酯(ecg)及蘆丁。 2．茯磚茶降脂減肥功效的高通量篩選與動物試驗 本研究首次運用高通量藥物篩選技術研究了茯磚茶水提物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后所得各萃取部分及茶渣醇提物對與降脂減肥作用相關的pparα、pparσ、pparγ、lxr、fxr及3t3-l1模型的作用效果。結果表明，所有樣品對3t3-l1細胞的抑制作用及對pparα模型的激活作用不明顯，而對fxr模型都有激活作用。乙醇提取物對fxr模型的激活效果最好，激活倍數達2.313，其次是乙酸乙酯萃取層，激活倍數達2.083，激活作用都相當顯著；水層對fxr模型的抑制作用最明顯，其次是正丁醇萃取層。正丁醇萃取層對lxr模型有激活作用。三氯甲烷萃取層及水層樣品對ppar7有一定的激活作用；綜合效果最好的是乙酸乙酯萃取層，對ppar8、parγ、lxr及fxr模型均有較強的激活作用，且激活倍數均在1.80以上。 對從茯磚茶乙酸乙酯萃取部分分離制備的5個單體化合物進行高通量藥物篩選研究，結果表明，egcg的兩種初篩濃度對fxr模型的激活作用均較強，特別是50μg／ml的初篩濃度時，其激活倍數達6.000；ecg在50μg／ml的初篩濃度下作用很明顯，達3.220。沒食子兒茶素對fxr激活模型、pparδ及γ模型、lxr模型均有效果，對pparγ模型的激活倍數達1.619。3-甲氧基-4，5-二羥基苯甲酸對fxr抑制模型、pparγ模型、lxr模型均有效果，對pparγ模型的激活倍數達1.734。3，4-二羥基苯甲酸對fxr模型的抑制值為3.641，明顯小于對照cdca的抑制值6.435，因此其對抑制模型的作用非常明顯。以上研究結果說明這幾個化合物均為茯磚茶的活性成分。 以0.085、0.170、0.510 g／kg·bw劑量的茯磚茶提取物給大鼠灌胃30d，與高脂對照比較，0．170g／kg·bw劑量可顯著降低高脂飼料大鼠血清tc、tg水平(p＜0．01)，各劑量對大鼠血清hdl水平無顯著影響(p＞0．05)。 3．茯磚茶降脂減肥的作用機理 茯磚茶通過激活pparδ以激活靶基因，使體型變瘦并改善血脂狀況，延緩動脈粥樣硬化的發展，有效逆轉動脈粥樣硬化損傷時泡沫細胞中的膽固醇沉積。 茯磚茶激活pparγ調節脂肪細胞信號轉導的作用，誘導脂肪細胞特異性基因的產生，減少與代謝綜合癥相關的心血管疾病的發生；使骨骼肌中脂肪酸分解代謝增加。 茯磚茶通過激活lxr的活性，增加膽固醇從肝中排出，減少小腸對膽固醇的吸收，從而調節血脂的水平，并調節脂蛋白代謝。 茯磚茶一方面通過激活fxr模型增加極低密度脂蛋白(vldl)和乳糜微粒(cm)中的甘油三酯的水解，降低vldl和低密度脂蛋白(ldl)的水平，增加高密度脂蛋白(hdl)的合成，減少血．漿中甘油三酯的水平；另一方面，通過抑制fxr模型，促進肝中膽固醇分解成膽汁酸排泄到小腸中并排出體外，降低血液中膽固醇的含量，從而起到降血脂的功效。 茯磚茶提取物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后，所得樣品對胰脂肪酶活性的影響程度不同，三氯甲烷萃取層稍有抑制作用，水提物、乙酸乙酯萃取層及正丁醇萃取層有較明顯的激活作用，正丁醇萃取層部分激活作用最明顯，達2.54倍。 茯磚茶各部分對α-淀粉酶活性均有激活作用，其中以乙酸乙酯萃取部位的激活作用最強，激活倍數為對照的4.09倍，其次是水提物，其激活倍數為對照的2.99倍；水層的激活作用最弱，其激活倍數為1.20倍；三氯甲烷萃取層稍有抑制作用。 乙酸乙酯及正丁醇萃取層部分經過hp-20樹脂再分離后，各部分仍有較高的活性。 4．茯磚茶加工過程中主要化學成分的變化規律 茯磚茶由于發花工序而形成完全不同于黑毛茶的品質特征。茯磚茶加工過程中幾種主要化學成分含量變化的測定結果表明，各種化學成分均有不同程度的減少，其中兒茶素、黃酮類及茶多酚總量減少最多，分別減少了63.64％、51.52％、54.62％，氨基酸下降36.84％，咖啡堿下降10.85％，可溶性糖及水浸出物變化不大。“發花”工序是各成分含量下降最快的環節，由于有大量冠突散囊菌等微生物的參與及適度的濕熱作用使化學成分發生變化，從而形成了茯磚茶獨特的品質。 5．動物試驗證明茯磚茶無毒 通過周密的試驗設計研究了茯磚茶的毒理作用，結果表明茯磚茶對雄性小鼠的急性經口ld_(50)為14700 mg／kg·bw，對雌性小鼠的急性經口ld_(50)為19600 mg／kg·bw(95％可信限為10600-36000)，ames及致小鼠精子畸形試驗均為陰性。以0.85％、1.25％、1.70％的茯磚茶提取物摻入飼料中喂飼大鼠30d，試驗期間，各組動物生長發育良好。雌鼠血清膽固醇及1.25％、1.70％劑量組的血清谷丙轉氨酶均顯著低于對照組(p＜0.05或p＜0.01)，樣品0.85％劑量對肝／體比值雖顯著升高，但無生物學意義。各劑量組對雌雄鼠血像、雄鼠血生化各項、甘油三酯、尿素酐、血肌酐、血糖和雌雄鼠脾／體、腎／體比值、組織病理無顯著影響(p＜0.05)。毒性試驗綜合結果證明，茯磚茶樣品30d喂養對雌雄大鼠無明顯毒副作用，茯磚茶屬實際無毒級。
【關鍵詞】：茯磚茶 降脂減肥 高通量藥物篩選 分離純化 結構鑒定
【學位授予單位】：湖南農業大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：s571.1
【doi】：cnki:cdmd:1.2007.208186
【目錄】：
中文摘要8-11
英文摘要11-15
第一章 緒論15-28
1 國內外研究進展15-25
1.1 肥胖產生的原因及危害15-16
1.2 高血脂癥產生的原因及危害16
1.3 茶葉降脂減肥的研究進展16-20
1.4 茯磚茶研究進展20-21
1.5 高通量篩選在天然產物開發中的作用及相關模型的研究進展21-25
2 研究的目的和意義25-26
3 研究內容及關鍵技術26-28
3.1 研究內容26-27
3.2 關鍵技術27-28
第二章 茯磚茶活性成分的分離鑒定28-54
1 材料與方法28-32
1.1 材料28
1.2 儀器及試劑28-29
1.3 技術路線29
1.4 方法29-32
2 結果與分析32-53
2.1 吸附樹脂的優選32-34
2.2 茯磚茶乙酸乙酯萃取層部分活性成分分離34-36
2.3 正丁醇萃取層部分活性成分分離36
2.4 單體化合物類別判斷36-37
2.5 單體成分結構鑒定37-53
3 討論53-54
第三章 茯磚茶降脂減肥功效的高通量篩選研究54-70
1 材料及方法54-59
1.1 材料54
1.2 技術路線54-55
1.3 方法55-59
2 結果與分析59-66
2.1 茯磚茶對ppars、lxr、3t3-l1模型的作用59-63
2.2 茯磚茶對fxr模型的作用63-64
2.3 茯磚茶功能成分單體的高通量篩選研究64-66
3 討論66-70
3.1 高通量篩選方法是茯磚茶降脂減肥功效研究的快速、準確的方法66-67
3.2 茯磚茶降脂減肥機理探討67-68
3.3 茯磚茶更多的降脂活性成分有待進一步研究68-70
第四章 茯磚茶對代謝酶活性的影響70-76
1 材料和方法70-71
1.1 材料70
1.2 主要儀器設備70
1.3 樣品制備及內含成分含量測定70
1.4 酶活檢測方法70-71
2 結果與分析71-74
2.1 茯磚茶不同部位主要有效成分分析71-72
2.2 茯磚茶各部分對α-淀粉酶活性的影響72-73
2.3 茯磚茶各部分對胰脂肪酶活性的影響73-74
3 討論74-76
3.1 茯磚茶有利于提高α-淀粉酶的活性74
3.2 茯磚茶對脂肪酶有激活作用74-75
3.3 茯磚茶是游牧民族的首選飲料75-76
第五章 茯磚茶加工過程中主要化學成分的變化76-82
1 材料和方法76-77
1.1 材料與設備76
1.2 取樣76
1.3 主要生化成分的分析方法76-77
2 結果與分析77-79
2.1 茯磚茶制造過程中幾種主要內含成分含量的變化77-78
2.2 茯磚茶制造過程中兒茶素各組分含量的變化78-79
3 討論79-82
3.1 茯磚茶加工過程中兒茶素下降是多種因素綜合作用的結果79-80
3.2 氨基酸是茯磚茶香氣滋味物質形成的重要前體80
3.3 咖啡堿及可溶性糖類物質的變化是茯磚茶滋味醇和的重要原因80-81
3.4 茯磚茶各內含成分協調變化的結果是其品質形成的生化基礎81-82
第六章 茯磚茶降血脂功效及毒理的動物試驗82-92
1 材料與方法82-84
1.1 樣品82
1.2 試驗動物82
1.3 試驗環境條件82
1.4 劑量選擇82
1.5 主要儀器與試劑82-83
1.6 高脂飼料83
1.7 檢測方法83-84
1.8 檢驗依據84
1.9 試驗數據統計84
2 結果與分析84-91
2.1 降血脂作用84-86
2.2 茯茶對小鼠的毒理試驗86-88
2.3 茯茶對大鼠的毒理試驗88-91
3 結論91-92
3.1 茯磚茶可以開發成高脂血癥的治療藥物或保健品91
3.2 茯磚茶是安全飲料91-92
全文結論92-96
創新點96-97
展望97-98
參考文獻98-106
附圖106-129
縮寫詞129-130
致謝130-131
作者簡介131
本文系湖南農業大學博士論文，論文全部內容請到相應學術機構咨詢購買，中國黑茶網不提供全文閱讀！
傅冬和
【摘要】： 隨著全球經濟的快速發展，人們生活水平的日益提高，高脂血癥及肥胖癥的患病率不斷上升，且已成為擺在人們面前的首要健康問題。肥胖癥及高脂血癥的預防和治療是當今全球健康產業關注的熱點，尋找天然、高效、安全的降脂減肥藥物或保健食品是全球科技領域和產業領域十分關注的課題。 茶為藥用歷史悠久，隨著現代科學技術的進步和對茶葉藥理功能研究的深入，業已證明茶葉具有降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理功能。湖南是我國茯磚茶的主產區，茯磚茶是邊疆少數民族同胞經歷多年選擇的、日不可缺的必備飲品。本研究采用現代分離純化技術逐級深入分離茯磚茶的有效成分，同步采用高通量篩選、代謝酶活性測試及動物試驗，系統地研究茯磚茶的降脂減肥功效，獲得了如下研究成果： 1．茯磚茶功能成分分離及結構鑒定 將現代分離技術與高通量藥物篩選技術相結合，分離和確定茯磚茶的主要活性成分，首次從茯磚茶中分離得到8個單體化合物。通過綜合運用紅外、紫外、質譜、核磁共振、高效薄層及高效液相色譜等分析技術，確定此8個化合物分別為：沒食子酸、沒食子兒茶素(gc)、3-甲氧基-4，5-二羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、表沒食子酸兒茶素(egc)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)、表兒茶素沒食子酸酯(ecg)及蘆丁。 2．茯磚茶降脂減肥功效的高通量篩選與動物試驗 本研究首次運用高通量藥物篩選技術研究了茯磚茶水提物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后所得各萃取部分及茶渣醇提物對與降脂減肥作用相關的pparα、pparσ、pparγ、lxr、fxr及3t3-l1模型的作用效果。結果表明，所有樣品對3t3-l1細胞的抑制作用及對pparα模型的激活作用不明顯，而對fxr模型都有激活作用。乙醇提取物對fxr模型的激活效果最好，激活倍數達2.313，其次是乙酸乙酯萃取層，激活倍數達2.083，激活作用都相當顯著；水層對fxr模型的抑制作用最明顯，其次是正丁醇萃取層。正丁醇萃取層對lxr模型有激活作用。三氯甲烷萃取層及水層樣品對ppar7有一定的激活作用；綜合效果最好的是乙酸乙酯萃取層，對ppar8、parγ、lxr及fxr模型均有較強的激活作用，且激活倍數均在1.80以上。 對從茯磚茶乙酸乙酯萃取部分分離制備的5個單體化合物進行高通量藥物篩選研究，結果表明，egcg的兩種初篩濃度對fxr模型的激活作用均較強，特別是50μg／ml的初篩濃度時，其激活倍數達6.000；ecg在50μg／ml的初篩濃度下作用很明顯，達3.220。沒食子兒茶素對fxr激活模型、pparδ及γ模型、lxr模型均有效果，對pparγ模型的激活倍數達1.619。3-甲氧基-4，5-二羥基苯甲酸對fxr抑制模型、pparγ模型、lxr模型均有效果，對pparγ模型的激活倍數達1.734。3，4-二羥基苯甲酸對fxr模型的抑制值為3.641，明顯小于對照cdca的抑制值6.435，因此其對抑制模型的作用非常明顯。以上研究結果說明這幾個化合物均為茯磚茶的活性成分。 以0.085、0.170、0.510 g／kg·bw劑量的茯磚茶提取物給大鼠灌胃30d，與高脂對照比較，0．170g／kg·bw劑量可顯著降低高脂飼料大鼠血清tc、tg水平(p＜0．01)，各劑量對大鼠血清hdl水平無顯著影響(p＞0．05)。 3．茯磚茶降脂減肥的作用機理 茯磚茶通過激活pparδ以激活靶基因，使體型變瘦并改善血脂狀況，延緩動脈粥樣硬化的發展，有效逆轉動脈粥樣硬化損傷時泡沫細胞中的膽固醇沉積。 茯磚茶激活pparγ調節脂肪細胞信號轉導的作用，誘導脂肪細胞特異性基因的產生，減少與代謝綜合癥相關的心血管疾病的發生；使骨骼肌中脂肪酸分解代謝增加。 茯磚茶通過激活lxr的活性，增加膽固醇從肝中排出，減少小腸對膽固醇的吸收，從而調節血脂的水平，并調節脂蛋白代謝。 茯磚茶一方面通過激活fxr模型增加極低密度脂蛋白(vldl)和乳糜微粒(cm)中的甘油三酯的水解，降低vldl和低密度脂蛋白(ldl)的水平，增加高密度脂蛋白(hdl)的合成，減少血．漿中甘油三酯的水平；另一方面，通過抑制fxr模型，促進肝中膽固醇分解成膽汁酸排泄到小腸中并排出體外，降低血液中膽固醇的含量，從而起到降血脂的功效。 茯磚茶提取物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后，所得樣品對胰脂肪酶活性的影響程度不同，三氯甲烷萃取層稍有抑制作用，水提物、乙酸乙酯萃取層及正丁醇萃取層有較明顯的激活作用，正丁醇萃取層部分激活作用最明顯，達2.54倍。 茯磚茶各部分對α-淀粉酶活性均有激活作用，其中以乙酸乙酯萃取部位的激活作用最強，激活倍數為對照的4.09倍，其次是水提物，其激活倍數為對照的2.99倍；水層的激活作用最弱，其激活倍數為1.20倍；三氯甲烷萃取層稍有抑制作用。 乙酸乙酯及正丁醇萃取層部分經過hp-20樹脂再分離后，各部分仍有較高的活性。 4．茯磚茶加工過程中主要化學成分的變化規律 茯磚茶由于發花工序而形成完全不同于黑毛茶的品質特征。茯磚茶加工過程中幾種主要化學成分含量變化的測定結果表明，各種化學成分均有不同程度的減少，其中兒茶素、黃酮類及茶多酚總量減少最多，分別減少了63.64％、51.52％、54.62％，氨基酸下降36.84％，咖啡堿下降10.85％，可溶性糖及水浸出物變化不大。“發花”工序是各成分含量下降最快的環節，由于有大量冠突散囊菌等微生物的參與及適度的濕熱作用使化學成分發生變化，從而形成了茯磚茶獨特的品質。 5．動物試驗證明茯磚茶無毒 通過周密的試驗設計研究了茯磚茶的毒理作用，結果表明茯磚茶對雄性小鼠的急性經口ld_(50)為14700 mg／kg·bw，對雌性小鼠的急性經口ld_(50)為19600 mg／kg·bw(95％可信限為10600-36000)，ames及致小鼠精子畸形試驗均為陰性。以0.85％、1.25％、1.70％的茯磚茶提取物摻入飼料中喂飼大鼠30d，試驗期間，各組動物生長發育良好。雌鼠血清膽固醇及1.25％、1.70％劑量組的血清谷丙轉氨酶均顯著低于對照組(p＜0.05或p＜0.01)，樣品0.85％劑量對肝／體比值雖顯著升高，但無生物學意義。各劑量組對雌雄鼠血像、雄鼠血生化各項、甘油三酯、尿素酐、血肌酐、血糖和雌雄鼠脾／體、腎／體比值、組織病理無顯著影響(p＜0.05)。毒性試驗綜合結果證明，茯磚茶樣品30d喂養對雌雄大鼠無明顯毒副作用，茯磚茶屬實際無毒級。
【關鍵詞】：茯磚茶 降脂減肥 高通量藥物篩選 分離純化 結構鑒定
【學位授予單位】：湖南農業大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：s571.1
【doi】：cnki:cdmd:1.2007.208186
【目錄】：
中文摘要8-11
英文摘要11-15
第一章 緒論15-28
1 國內外研究進展15-25
1.1 肥胖產生的原因及危害15-16
1.2 高血脂癥產生的原因及危害16
1.3 茶葉降脂減肥的研究進展16-20
1.4 茯磚茶研究進展20-21
1.5 高通量篩選在天然產物開發中的作用及相關模型的研究進展21-25
2 研究的目的和意義25-26
3 研究內容及關鍵技術26-28
3.1 研究內容26-27
3.2 關鍵技術27-28
第二章 茯磚茶活性成分的分離鑒定28-54
1 材料與方法28-32
1.1 材料28
1.2 儀器及試劑28-29
1.3 技術路線29
1.4 方法29-32
2 結果與分析32-53
2.1 吸附樹脂的優選32-34
2.2 茯磚茶乙酸乙酯萃取層部分活性成分分離34-36
2.3 正丁醇萃取層部分活性成分分離36
2.4 單體化合物類別判斷36-37
2.5 單體成分結構鑒定37-53
3 討論53-54
第三章 茯磚茶降脂減肥功效的高通量篩選研究54-70
1 材料及方法54-59
1.1 材料54
1.2 技術路線54-55
1.3 方法55-59
2 結果與分析59-66
2.1 茯磚茶對ppars、lxr、3t3-l1模型的作用59-63
2.2 茯磚茶對fxr模型的作用63-64
2.3 茯磚茶功能成分單體的高通量篩選研究64-66
3 討論66-70
3.1 高通量篩選方法是茯磚茶降脂減肥功效研究的快速、準確的方法66-67
3.2 茯磚茶降脂減肥機理探討67-68
3.3 茯磚茶更多的降脂活性成分有待進一步研究68-70
第四章 茯磚茶對代謝酶活性的影響70-76
1 材料和方法70-71
1.1 材料70
1.2 主要儀器設備70
1.3 樣品制備及內含成分含量測定70
1.4 酶活檢測方法70-71
2 結果與分析71-74
2.1 茯磚茶不同部位主要有效成分分析71-72
2.2 茯磚茶各部分對α-淀粉酶活性的影響72-73
2.3 茯磚茶各部分對胰脂肪酶活性的影響73-74
3 討論74-76
3.1 茯磚茶有利于提高α-淀粉酶的活性74
3.2 茯磚茶對脂肪酶有激活作用74-75
3.3 茯磚茶是游牧民族的首選飲料75-76
第五章 茯磚茶加工過程中主要化學成分的變化76-82
1 材料和方法76-77
1.1 材料與設備76
1.2 取樣76
1.3 主要生化成分的分析方法76-77
2 結果與分析77-79
2.1 茯磚茶制造過程中幾種主要內含成分含量的變化77-78
2.2 茯磚茶制造過程中兒茶素各組分含量的變化78-79
3 討論79-82
3.1 茯磚茶加工過程中兒茶素下降是多種因素綜合作用的結果79-80
3.2 氨基酸是茯磚茶香氣滋味物質形成的重要前體80
3.3 咖啡堿及可溶性糖類物質的變化是茯磚茶滋味醇和的重要原因80-81
3.4 茯磚茶各內含成分協調變化的結果是其品質形成的生化基礎81-82
第六章 茯磚茶降血脂功效及毒理的動物試驗82-92
1 材料與方法82-84
1.1 樣品82
1.2 試驗動物82
1.3 試驗環境條件82
1.4 劑量選擇82
1.5 主要儀器與試劑82-83
1.6 高脂飼料83
1.7 檢測方法83-84
1.8 檢驗依據84
1.9 試驗數據統計84
2 結果與分析84-91
2.1 降血脂作用84-86
2.2 茯茶對小鼠的毒理試驗86-88
2.3 茯茶對大鼠的毒理試驗88-91
3 結論91-92
3.1 茯磚茶可以開發成高脂血癥的治療藥物或保健品91
3.2 茯磚茶是安全飲料91-92
全文結論92-96
創新點96-97
展望97-98
參考文獻98-106
附圖106-129
縮寫詞129-130
致謝130-131
作者簡介131
本文系湖南農業大學博士論文，論文全部內容請到相應學術機構咨詢購買，中國黑茶網不提供全文閱讀！